1. TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN DI ADN
1.1. Bóc tách chiết ADN
Ở tế bào Eukaryota, phần ADN đa phần nằm trong nhân tế bào, trên các NST, bởi vậy trước nhất cần biểu lộ ADN thoát ra khỏi màng nhân, thoát ra khỏi tế bào. Dưới đây là quá trình chủ yếu của quy trình:
- cách 1: giải hòa ADN thoát ra khỏi màng tế bào bằng phương pháp nghiền, dùng áp suất, khôn xiết âm hoặc dùng cách thức hóa học hoặc dùng cách thức sinh học (dùng enzym). Sau đó, láo lếu dịch được ly trọng tâm để loại bỏ chủ yếu những mảnh vụn của tế bào.
Bạn đang xem: Các kỹ thuật sinh học phân tử
- bước 2: bóc bỏ phần protein trong tế bào, vào NST. Proteinase K hay được dùng. Ly trọng điểm để sa thải phần tủa của proteinase K (tủa bởi phenol, chloroform).
- bước 3: kết tủa ADN (thường sử dụng Ethanol). ADN tủa được để khô ở nhiệt độ phòng và mang lại tan vào đệm TE (Tris, EDTA) và giữ nghỉ ngơi nhiệt độ: - 40 C. Để bảo quản lâu dài, hỗn hợp ADN được bảo vệ ở -200C cho -800C.
1.2. Tách chiết ARN
Phương pháp bóc chiết ARN toàn phần cũng bao gồm các bước cơ phiên bản như đối với ADN:
- giải tỏa ADN cùng ARN ra khỏi màng tế bào.
- tách bóc loại cho chỗ protein.
- Tủa acid nucleic.
Bước tiếp theo: dịch chiết cất acid nucleic được ủ với ADNase nhằm phân hủy ADN, tiếp nối hòa chảy dịch chiết chứa ARN vào nước; tủa bởi ethanol, để thu được ARN toàn phần. MARN hoàn toàn có thể được tách riêng. Dựa vào cấu trúc phân tử mARN tất cả đuôi poly A gồm thể tách mARN bằng sắc cam kết ái lực trên cột oligo T - cellulose. Hiện giờ đã thực hiện bộ kit (bộ chủng loại thử chuyên dụng) sử dụng các viên bi từ bao gồm mang oligo T trên bề mặt. Trải qua liên kết bổ sung A = T các mARN bám lên bề mặt các viên bi từ; tiếp nối bằng kỹ thuật ly trung khu thu lại các viên bi và tách mARN. Nghệ thuật này mang lại phép bóc giữ lại mARN với trọng lượng rất nhỏ.
Chú ý: trong quy trình thao tác, kị lẫn ADN, ARN của đối tượng khác vào dụng cụ. Tránh những enzym tiêu diệt ADN hoặc ARN nên nghiên cứu, đặc biệt quan trọng ARN ko bền dễ bị phân ly vì ARNase. Sau khi bóc chiết ADN, kiểm tra độ thuần khiết của ADN bằng xác định tỷ lệ OD260/OD280 và CD260/CD280 =1,7-2 được coi là sạch hoặc bằng phương pháp điện di ADN (xem phần thực tập).
1.3. Điện di ADN
Acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường gồm điện cầm cố và cường độ tương thích ADN, ARN dịch rời từ cực âm đến cực dương.
Để khám nghiệm và xác minh tính chất của ADN, đề xuất điện di ADN trên thạch (gel). Phân tử ADN càng nhỏ càng cầm tay nhanh. Tùy theo size của phân tử ADN mà tín đồ ta dùng những loại gel khác nhau:
- Phân tử ADN có dưới 500 song Nu sử dụng polyacrylamid gel
- Phân tử ADN có dưới 500 - 10.000 Nu cần sử dụng Agarose gel
- Phân tử ADN có rất nhiều đôi Nu hơn sử dụng Agarose gel có lỗ to ra thêm (Pulsed field agarose gel).
Để quan ngay cạnh hình hình ảnh ADN khi năng lượng điện di, bạn ta nhuộm ADN bởi ethidium bromide, dưới tia nắng tử ngoại, ADN đính thêm với ethidium bromide đang phát sáng.
Khi mang đến chạy điện di ADN phân tích thường bao gồm ADN mẫu (Marker) thuộc chạy nhằm so sánh, xác định số lượng Nu của đoạn ADN.
Phương pháp năng lượng điện di ADN còn được dùng làm kiểm tra kết quả bóc chiết ADN.
2. PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (polymerase chain reaction: PCR)
Phương pháp này được Mullis và cùng sự khuyến cáo vào năm 1985.
Mục đích phương pháp: phát hiện với nhân đoạn ADN những lần vào ống nghiệm.
Để tiến hành được phương pháp cần có: phân tử ADN ban đầu, hai đoạn ADN mồi (primers), từng mồi gồm khoảng 20 base, hai
mồi này gắn ở nhị đầu của phân tử ADN ban đầu: mồi ngược cùng mồi xuôi. 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu ánh sáng cao; enzym này được tách bóc chiết từ loài vi trùng Thermus aquaticus.
Phương pháp PCR tiến hành qua nhiều chu kỳ, mồi chu kỳ luân hồi gồm 3 giai đoạn:
- tiến độ biến tính: ủ ADN thuở đầu ở nhiệt độ cao: 92 - 950C để tách ADN thành sợi đơn.
- quy trình tiến độ lai ghép: ADN mồi được lai ghép với sợi đối kháng của ADN ban đầu. Tiến hành ở sức nóng độ: 50 - 520C.
- tiến độ tổng đúng theo ADN: Taq polymerase điều khiển và tinh chỉnh sự lắp tiếp những Nu vào sau ADN mồi dựa ADN ban sơ làm khuôn. Triển khai ở nhiệt độ độ: 70 - 720C. Sau từng chu kỳ, xuất phát từ 1 phân tử ADN lúc đầu tổng hợp yêu cầu hai phân tử ADN, đến chu kỳ sau nhị phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp đề xuất 4 phân tử ADN.
.Qua các giai đoạn như sẽ nêu làm việc trên, cùng cứ như vậy thực hiện tiếp các chu kỳ sau. Sau 30 chu kỳ từ 1 phân tử ADN lúc đầu sẽ gồm 230 phân tử được chế tác thành
Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhậy, từ 1 lượng ADN khôn cùng ít ban đầu, cùng với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau khi áp dụng phương thức PCR sẽ có một lượng to ADN đủ cần sử dụng cho phần đông chẩn đoán, nghiên cứu. Phương pháp PCR trong tương đối nhiều trường vừa lòng đã sửa chữa thay thế cho phương thức Southern blotting vì phương pháp này triển khai nhanh, buộc phải lượng ADN ít.
Từ phương thức PCR ban đầu, thời nay người ta đã đề xuất nhiều cải biến hóa để nâng cấp tính năng của phương pháp.
- PCR lồng (Nested PCR): trong kỹ thuật này dùng hai cặp mồi, tất cả trình tự những Nu lồng sát vào nhau (có nghĩa rằng cặp mồi máy hai tất cả trình tự các Nu nằm trong cặp mồi trang bị nhất). Đoạn ADN được tổng hợp bởi cặp mồi trước tiên được dùng làm khuôn mẫu đến PCR lần thứ 2. Điều này đang làm tăng cường mức độ đặc hiệu của phản nghịch ứng PCR. Nó chỉ nhân lên đoạn quánh hiệu của ADN lần 1, đôi khi nó sẽ không nhân lên với những thành phầm không đặc hiệu của lần 1.
- Nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang: QF - PCR (quantitative - fluorescense - polymerase chain reaction): năm 1993, Manfield lần đầu tiên ứng dụng phương pháp nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang đãng - từ năm 1998 đến nay một vài phòng thí điểm đã triển khai thành công kỹ thuật này vào chẩn dự báo sinh hội chứng Down. Ví dụ: dựa vào kết quả định lượng gene DSCR1 (gen được định vị ở vùng 21q21.1 - q 22.2 liên quan đến biến dạng tim cùng chậm trở nên tân tiến tâm thần của hội triệu chứng Down), để xác định thai bị Down hoặc không.
3. XÁC ĐỊNH TRÌNH từ bỏ NUCLEOTID vào PHÂN TỬ ADN (Sequencing)
Về nguyên tắc người ta rất có thể xác định trình tự những Nu vào cả bộ gen (genome) nhưng lại trong đk hiện nay, người ta bắt đầu chỉ xác định trình tự Nu ở rất nhiều đoạn ADN xác định.
Sau đó là hai cách thức đã được vận dụng để thực hiện xác minh trình từ bỏ Nu: cách thức hóa học và phương thức enzym học, trong đó cách thức enzym học tập được áp dụng nhiều.
3.1. Phương thức enzym học (phương pháp Sanger)
Nguyên lý của phương pháp này là dùng những dideoxyribonucleotid để tránh đính thêm các Nu tiếp theo. Phương pháp gồm những bước:
- cách 1: Phân tử cần xác minh trình tự các Nu được sử dụng làm khuôn để tổng hòa hợp nên một trong những đoạn ADN cùng ban đầu ở 1 vị trí giống nhau nhưng ngừng ở vị trí khác nhau. Phản ứng tổng hợp bao gồm ADN polymerase xúc tác in vitro.
Trong 4 ống thử có những thành phần kiểu như nhau là sợi ADN khuôn, 4 một số loại Nu (dATP, dCTP, dGPT, dTTP). Đánh dấu phóng xạ 32P cho 1 loại dideoxyribonucleotid lấy ví dụ như ddATP. Sự khác nhau là ở trong phần trong mỗi ống sẽ bổ sung thêm moi các loại dideoxyribonucleotid không giống nhau.
Ví dụ ống 1 mang đến ddATP, ống 2 đến ddGTP, ống 3 mang lại ddCTP và ống 4 đến ddTTP.
- bước 2: trong quá trình tổng hợp sử dụng dideoxyribonucleotid là Nu bị mất team OH tại phần thứ 3 nên những lúc nó được gắn vào chuỗi ADN thì không có sự lắp thêm Nu nữa. Hiện tượng lạ này sẽ tạo nên ra một thang gồm các đoạn ADN bao gồm chiều lâu năm khác nhau, biểu hiện rõ khi năng lượng điện di.
- cách 3: để khẳng định được địa chỉ của toàn bộ 4 nhiều loại Nu phải bao gồm sự phối kết hợp hình hình ảnh điện di của tất cả 4 ống biểu thị trên 4 làn với những băng khác nhau mà địa chỉ của từng băng đặc thù cho vị trí từng Nu cùng đọc cũng theo sản phẩm tự từ dưới lên. Toàn bộ các băng được hiểu bằng phương pháp tự chụp ảnh phóng xạ hoặc đánh dấu huỳnh quang.
3.2. Cách thức hóa học tập (phương pháp Maxam và Gilbert)
Nguyên lý của phương pháp là sử dụng hóa hóa học liều ít để tiêu diệt một trong bốn loại Nu khiến cho chuỗi ADN.
Các cách của cách thức như sau:
- cách 1: tách bóc ADN gai kép thành gai đơn, cho sợi solo tiếp xúc với hóa chất để tàn phá một trong tư loại base (ví dụ A). Vì chỉ giải pháp xử lý liều ít buộc phải hóa hóa học chỉ tiêu diệt một trong những A có mặt. Bí quyết xử lý này sinh sản ra một vài đoạn ADN có chiều dài khác biệt phản ánh vị trí của A đã biết thành phá diệt theo trình từ bỏ chuỗi.
- bước 2: những đoạn ADN này được năng lượng điện di bên trên gel, được vạc hiện bằng tự chụp hình phóng xạ: chỉ những
đoạn ADN sẽ được đánh dấu 32P làm việc đầu 5" new được biểu hiện rõ trên gel, size của chúng bộc lộ khoảng bí quyết từ đầu lưu lại đến vị trí A cần xác định.
- bước 3: nhằm xác xác định trí của tất cả các Nu vào phân tử ADN, biện pháp xử lý như trên được tiến hành đồng thời với 4 ống mang đến 4 một số loại Nu, thông thường T mang lại mẫu 1, C cho ống 2, G mang đến ống 3, và A đến ống 4.
- bước 4: gọi vị trí những Nu giống như như phương thức enzym. Vị trí của 4 một số loại Nu biểu lộ bằng 4 làn băng, địa điểm được gọi từ dưới lên vì các đoạn nhỏ tuổi khi điện di chạy cấp tốc hơn các đoạn có kích thước lớn.
4. ENZYM GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYM GIỚI HẠN
4.1. Enzym giới hạn (Restriction enzyme)
Enzym giới hạn hay có cách gọi khác là enzym tinh giảm có điểm lưu ý là giảm ADN ở phần đông vị trí xác định. Cho đến bây giờ người ta đã biết khoảng chừng trên 500 loại enzym giới hạn. Các loại enzym giới hạn có các đặc điểm sau:
- những loại enzym số lượng giới hạn đều được chiết bóc từ vi khuẩn. Thương hiệu của enzym số lượng giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn (xem bảng 3.1).
- cắt phân tử ADN xoắn kép ở phần đa vị trí xác minh cho từng loại enzym giới hạn.
- địa điểm cắt thông thường sẽ có 4 - 8 Nu, sệt trưng quan trọng đặc biệt nhất của trình tự phân biệt là đoạn ADN có 4 mang đến 8 cặp Nu này có trình tự kiểu như nhau khi phát âm theo chiều 5’ - 3’. Vì vậy vị trí cắt của enzym tương tự nhau trên 2 mạch (xem vị trí cắt ở bảng 3.1).
- sau thời điểm bị giảm ADN có những đầu kết dán ở những sợi đơn. Cùng bị giảm với cùng các loại enzym giới hạn, những phân tử ADN có những đầu dính nối với các Nu bổ sung cập nhật cho nhau.
4.2. Tác dụng của enzym giới hạn
Enzym số lượng giới hạn ở vi trùng có mục đích phân giải ADN của virus khi virus xâm nhập vào vi khuẩn. Trong vi trùng có enzym thay đổi đế methyl hóa enzym giới hạn làm cho enzym số lượng giới hạn mất hoạt tính, không tác động đến ADN của vi khuẩn.
Chức năng cắt của enzym giới hạn đã khiến cho phân tử ADN dài tất cả thế bị giảm ra từng đoạn đế phân tích. Sau khoản thời gian bị cắt, các đoạn ADN gồm thế được điện di trên agarose gel đế khẳng định tính chất, hoặc dùng đế tạo cho các phân tử ADN lai.
5. LAI ACID NUCLEIC
5.1. ADN dò (DNA probes)
Trước khi tiến hành các kỹ thuật lai acid nucleic tín đồ ta phải tạo ra các ADN dò.
ADN dò là một trong đoạn ADN sợi solo mà trình từ Nu, tính chất của bọn chúng đã được biết. Một số trong những loại ADN dò sẽ được cung cấp tại thị trường. Mang tên như vậy bởi vì ADN dò có tính năng dò tìm số đông đoạn ADN gai đơn tương xứng trên các phân tử ADN cần phải phân tích, ví dụ những đoạn ADN bất thường trong một vài bệnh đề xuất chẩn đoán.
Phương pháp tạo ra ADN dò:
- phương pháp sao mã ngược:
- phương thức tổng đúng theo từ những Nu theo một trình tự sẽ biết.
- Phương pháp tách bóc chiết tự ADN của cục gen.
Trong cách thức lai acid nucleic có phương pháp sử dụng cách thức lai những alen với các mẫu dò đặc hiệu (allele specific oligonucleotide), phương pháp thường sử dụng với các kỹ thuật sau
5.2. Các phương pháp lai acid nucleic
5.2.1. Cách thức Southern blottingKỹ thuật này được Southern phát hiện tại ra vào khoảng thời gian 1975.
Mục đích của kỹ thuật: dò kiếm tìm một phân tử ADN vào số rất nhiều phân tử ADN. Đây là một phương pháp đã được dùng để phát hiện nay bệnh ở tại mức độ phân tử. Southern blotting cũng khá được dùng trong không ít kỹ thuật lai ADN khác.
Các cách cơ phiên bản của kỹ thuật:
Tách tách ADN từ những mẫu đồ gia dụng như bạch cầu, từ bỏ tế bào nước ối, tế bào sống tua rau thai...
- Phân tử ADN được cắt bởi enzym giới hạn làm cho những đoạn ADN có form size khác nhau, trong các này có thể có đoạn với gen bắt buộc tìm.
- Điện di các đoạn ADN bên trên agarose gel: tùy theo kích thước của đoạn ADN cơ mà có các băng năng lượng điện di ở các vị trí không giống nhau.
- Để gel xúc tiếp với NaOH, NaOH làm biến đổi tính ADN thành sợi đơn (cắt các cầu nối hydro. Rất có thể dùng ánh nắng mặt trời cao làm biến chuyển tính ADN.
- sau thời điểm tráng gel được ném lên giấy thấm, giấy thấm gồm tiếp xúc cùng với dung dịch điện di, giấy nitrocellulose được khóa lên trên gel. Dùng một đồ gia dụng nặng nghiền lên trên giấy tờ thấm, ADN sẽ thấm từ bỏ gel lên giấy nitrocellulose.
- Sau cùng, giấy nitrocellulose sẽ thấm ADN được cho vào bình lai đã tất cả ADN dò. Nếu như phân tử ADN sợi đối kháng mang gen khớp ứng với ADN dò sẽ sở hữu sự phối kết hợp ADN sợi đối chọi với sợi đối kháng của ADN dò tạo nên phân tử lai theo nguyên tắc bổ sung của các cặp Nu. Trên giấy nitrocellulose đang hiện băng vì sự kết hợp ADN dò cùng với ADN đích. Băng này có thể nhìn thấy khi dùng tự chụp ảnh phóng xạ hoặc sử dụng hóa chất.
Xem thêm: Bản Đồ Quận Tân Bình Thành Phố Hồ Chính Minh 【Bản Đồ Việt Nam】
5.2.2. Phương pháp Northern blottingKhác với phương pháp Southern blotting, acid nucleic đích ở đó là ARN chứ chưa hẳn ADN. Phát hiện ARN bằng phương pháp lai với cADN đã khắc ghi cho yêu cầu kỹ thuật này được call là Northern blotting.
5.2.3. Cách thức Dot blotting - Slot blottingLai theo phương thức dot-blot là phương pháp sàng lọc nhanh thường triển khai với các mẫu dò ASO (allele-specific oligonucleotide) để tách biệt sự khác biệt giữa các alen ở đoạn một Nu. Phương pháp này không nên điện di bên trên thạch mà bởi thấm trực tiếp từ đó để xác minh những đoạn Nu khác nhau.
Quy trình triển khai của nghệ thuật qua công việc sau:
- bước 1: dung dịch ADN đích được thay đổi tính bằng ánh sáng hay bởi dung dịch kali để tách ADN sợi kép thành ADN sợi đơn.
- cách 2: lắp ADN đích vẫn được vươn lên là tính lên màng lai (màng nitrocellulose hoặc màng nylon).
- cách 3: chuyển màng lai đựng ADN đích vào dung dịch chứa ADN dò.
- bước 4: sau khoảng 20 - 24 giờ đồng hồ ADN dò sẽ đã nhập vào ADN đích tạo thành chuỗi kép.
- bước 5: rửa màng lai, để khô trường đoản cú nhiên tiếp nối phân tích bằng tự chụp ảnh phóng xạ.
Ngoài ra còn có thể gắn ADN dò lên màng lai, còn ADN đích được đặt ở trong dung dịch và quá trình tương từ bỏ như trên.
Phương pháp này vận dụng để sáng tỏ giữa những alen khác nhau thậm chí bởi một vài ba Nu. Với mục đích này bạn ta đã tạo thành những đầu dò ASO từ hầu hết chuỗi Nu có kích thước khác nhau. đầy đủ đầu dò ASO này thường xuyên chỉ tất cả từ 15 - 20 Nu và bình thường được vận động dưới những điều kiện lai, ở đó ADN kép được tạo ra do sự kết hợp giữa dò và đích nếu base bổ sung cập nhật giữa dò và đích là tương hợp. Nếu tất cả sự không cân xứng (chỉ nên một nối lệch) giữa ADN dò và đích thì làm cho chuỗi xoắn kép ko bền vững. Bằng cách tăng ánh nắng mặt trời tối đa có thể phát hiện đều chỗ nối lệch này. Mặc dù ASO có thể đã sử dụng phương pháp lai Southern blot, nhưng mà ASO được sử dụng thuận lợi hơn trong số những thực nghiệm dot-blot.
Nhìn phổ biến kỹ thuật của dot-blot bao hàm lấy được hỗn hợp ADN đích (có thể là tổng thể gen của người), nhưng dễ dàng hơn là thu được đầy đủ vết ADN sinh sống trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon.
Cần biệt lập kỹ thuật slot-blot với dot-blot. Nhị kỹ thuật này không giống nhau ở đông đảo vết ADN thu được. Đối cùng với dot-blot thì ADN thu được nằm tại trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon dạng vệt tròn, còn slot-blot thì ADN thu được nằm tại những rãnh mà bọn họ đã khía trước bên trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon.
5.2.4. Chuyên môn lai tại nơi huỳnh quang quẻ (Fluorescence in situ hybridization: FISH)
Cuối năm 1980, kỹ thuật FISH được ứng dụng rộng thoải mái để phát hiện các bất thường xuyên NST. Đây là kỹ thuật đặc biệt có chân thành và ý nghĩa trong chẩn dự đoán sinh vì chưng nó hoàn toàn có thể thực hiện nay trên nhân tế bào gian kỳ không nên qua thời hạn nuôi cấy. Do vậy, sau 24 - 48 giờ đã gồm kết quả. Chủng loại tế bào rất có thể lấy sớm tự tuần 12 (số lượng mẫu dịch ối 2 - 5 ml).
Kỹ thuật FISH là một trong kỹ thuật di truyền tế bào - phân tử áp dụng trình từ bỏ chuỗi ngắn ADN sợi đối kháng (ADN dò), những ADN dò sẽ tiến hành lai cùng với ADN đích trên tiêu bản NST sống kỳ thân hoặc gian kỳ. Bên dưới kính hiển vi huỳnh quang ta hoàn toàn có thể phát hiện, xác định những vị trí ADN dò lai cùng với ADN đích. Nhờ vậy, phát hiện tại được đông đảo rối loạn số lượng và cấu trúc NST.
Có các loại ADN dò cơ bản sau:
- ADN dò phần tâm: loại ADN dò này đa phần sử dụng nhằm phát hiện những bất thường số lượng NST với phát hiện các NST các tâm, đầy đủ mảnh không tâm.
- ADN dò đặc hiệu locus lai từng vùng của một NST: loại ADN dò đa phần phát hiện các đột biến đổi gen - các rối loạn cấu tạo NST như: nhân đoạn nhỏ, mất đoạn nhỏ dại v.v... Mà phương thức nhuộm băng ko phát hiện nay được.
- ADN dò cục bộ NST: dùng hầu hết ADN dò lai dọc theo chiều nhiều năm của một NST. Điều này được cho phép phân biệt các NST khác biệt dựa vào màu sắc của chúng. Phương pháp này chủ yếu phát hiện náo loạn số lượng, cấu tạo NST lấy ví dụ phát hiện khi một trong những phần của NST này gắn thêm một phần NST không giống trong ngôi trường hợp gửi đoạn.
- ko kể ra, còn tồn tại kỹ thuật mBand FISH (multicolor fluorescence in situ hybridization) để phát hiện những bất thường trên các vị trí băng NST.
- Ứng dụng kỹ thuật FISH vào chẩn dự đoán sinh hội chứng Down: sử dụng ADN dò NST 21; nếu như nhân tế bào gian kỳ có 2 biểu hiện lai → 2 NST 21; nếu có 3 bộc lộ lai → 3 NST 21.
5.2.5. Lai ADN trong technology sinh học tập - sản xuất gen solo dòng
Mục đích kỹ thuật: đưa đa số đoạn ADN (gen) quan trọng vào, thải trừ những đoạn ADN ăn hại để tạo nên những phân tử ADN lai quy định tổng đúng theo nên thành phầm (chế phẩm) có unique cao, với số lượng nhiều hơn, thời gian sản xuất ngắn hơn.
Để thực hiện được chuyên môn này cần: phân tử ADN cho (có quality tốt), phân tử ADN dấn (có kĩ năng nhân lên nhanh). Công việc cơ phiên bản của nghệ thuật này bao gồm:
- lựa chọn ADN mang đến và ADN dấn hay còn được gọi là vector (thể truyền). Vector thường được sử dụng là những plasmid của vi khuẩn, các phage, thỉnh thoảng người ta còn dùng những cosmid.
- sử dụng enzym giới hạn như nhau để giảm ADN cho và ADN của vector.
- cần sử dụng enzym nối (ligase) nhằm nối đoạn ADN mang lại và phân tử ADN vector để chế tạo phân tử lai.
- vào trường hợp ý muốn đưa phân tử ADN lai vào vi khuẩn, ví dụ vào E. Coli, fan ta dùng CaCl2 để tạo điều kiện cho phân tử lai xâm nhập vào vi khuẩn tiện lợi hơn. Những phân tử ADN được đưa vào vi khuẩn sẽ nhân lên, trong những số đó có đều phân tử lai, nhưng cũng có những phân tử chưa nhận ADN cho vày vậy cần phân lập riêng phân tử lai, ví dụ như trong trường hợp vi trùng kháng chống sinh, có vi trùng vẫn mọc trong môi trường kháng sinh (chưa nhận phân tử mang đến mang tính cảm ứng với kháng sinh), có vi khuẩn không mọc đựơc trong môi trường thiên nhiên đó do đoạn ADN mang ý nghĩa chất phòng kháng sinh đã được thay bằng đoạn ADN chạm màn hình với kháng sinh.
- Bằng cách thức vi sinh đồ học, tín đồ ta cấy truyền các khuẩn lạc mang ý nghĩa chất cần nghiên cứu.
- bạn ta cũng còn dùng cách thức chuyển các khuẩn lạc tự đĩa cấy petri thanh lịch giấy thấm, kế tiếp cho lai với ADN dò sau thời điểm đã làm biến hóa tính ADN đích, hiệu quả lai được đánh giá bằng tự chụp ảnh phóng xạ nhằm phát hiện khuẩn lạc cần tìm.
- Sự nhân lên các lần một các loại khuẩn lạc mang phân tử ADN đích nào kia trong vi trùng gọi là tạo cái invivo.
6. HIỆN TƯỢNG ĐA HÌNH VỀ CHIỀU DÀI CỦA CÁC ĐOẠN and DO ENZYM GIỚI HẠN TẠO NÊN (Restriction fragment length polymorphisms: RFLP)
Khi đã tất cả ADN dò mang đến một bệnh dịch nào đó thì bài toán chẩn đoán bệnh dịch đó có thể thực hiện bởi phương pháp
Southern blotting như sẽ nêu ở trên. Tuy thế thực tế, số ADN dò đang biết còn khôn xiết ít. Vào trường hợp chưa chắc chắn ADN dò, để chẩn đoán bệnh người ta có thể dùng một phương thức gián tiếp, kia là phương thức dùng các biến hóa tự nhiên của ADN hay còn được gọi là RFLP. Vậy RFLP là gì?
RFLP là hiện tượng lạ đa hình về chiều dài của những đoạn ADN vì chưng enzym số lượng giới hạn tạo nên.
Người ta cầu tính chỉ khoảng 10% ADN của tín đồ tham gia vào tổng thích hợp protein, phần sót lại có tác dụng chưa được rõ. Ở hầu hết đoạn ADN không thâm nhập tổng vừa lòng protein, hoàn toàn có thể có những thay đổi của những base tuy vậy không tác động đến mẫu mã hình. Tuy nhiên những sự biến hóa như vậy có thể được xác minh vì chúng làm chuyển đổi đoạn vì chưng enzym giới hạn tạo nên, làm chuyển đổi số lượng, chiều lâu năm đoạn được cắt. Ví dụ: trên phân tử ADN tất cả 3 vị trí cắt, bởi vậy 2 đoạn ADN được tạo nên thành, nhưng nếu gồm 2 vị trí cắt thì chỉ bao gồm một đoạn giảm được tạo ra thành. Phần nhiều sự thay đổi của những đoạn như vậy có thể được nhấn diện bằng phương thức điện di. Sự dìm diện những đoạn này phụ thuộc vào ADN dò được dùng, và phụ thuộc vào vị trí ADN dò được dùng. Nếu ren đích (ví dụ gen bệnh) link với địa chỉ của RFLP, có nghĩa là gen cùng vị trí RFLP ở trên cùng một NST với ở gần nhau tạo cho một tái tổng hợp di truyền trong quy trình giảm phân. Sự nghiên cứu và phân tích các ADN tái tổ hợp trong gia đình được cho phép chẩn đoán hình dạng gen. Bởi thế RFLP được dùng như một lốt ấn (marker) vào chẩn đoán căn bệnh trước sinh hoặc sau sinh ngay lập tức từ khi không có bộc lộ bệnh. RFLP cũng rất được dùng để phân biệt khung hình đồng vừa lòng hay cơ thể dị hợp. Kan cùng Dozy là đa số người thứ nhất dùng RFLP để chẩn đoán. Các tác giả đã chứng tỏ rằng trong gia đình có căn bệnh hồng cầu liềm (HbS) enzym giảm Hpa I đã giảm ADN và khiến cho các đoạn có kích thước khác nhau, một đoạn phân ly với gen lành, đoạn khác phân ly với gen HbS. Kỹ năng này được sử dụng cho chẩn đoán trước sinh.
Hiện tượng đa hình chiều dài của các đoạn bởi vì enzym số lượng giới hạn được dt theo quy biện pháp Mendel.
RFLP là một phương thức được dùng làm lập phiên bản đồ gen.
7. DẤU ẤN ADN (DNA Fingerprinting)
- mục tiêu của kỹ thuật: chuyên môn này nhằm mục đích phân biệt được người này với những người khác, thành viên cùng loài phụ thuộc vào sự có mặt và phân bố của những vạch ADN giống như khi sử dụng dấu vân da bàn tay.
- nguyên lý của kỹ thuật: một vệt ấn ADN có tên là VNTR (variable number of tandem repeats) hay nói một cách khác là microsatellite, bao gồm 11 cho tới 60 đôi base, vệt ấn này có mặt nhắc đi nhắc lại những lần trong cỗ gen. Sự có mặt của đoạn ADN lốt ấn này đặc thù cho từng cá thể.
- mốc giới hạn nhắc lại của dấu ấn này rất có thể khác nhau trong từng locus và những dấu ấn ADN giống như nhau có thể gặp mặt ở đều vị trí khác nhau của cỗ gen. Nếu locus gen phía bên trong phạm vi của đoạn bị cắt vì chưng enzym số lượng giới hạn thì chiều lâu năm của đoạn cắt biến hóa tùy theo chu kỳ nhắc lại của VNTR.
- Tính đa hình vì VNTR rất đặc trưng cho đề nghị kỹ thuật này đang được áp dụng trong việc xác định phụ hệ với trong y pháp.
- Kỹ thuật nhằm phát hiện nay VNTR: cũng bao gồm các cách như khi tiến hành Southern blotting đến cách chuyển VNTR sang trọng giấy nitrocellulose nhưng tiếp nối lai ADN đích với ADN dò để phát hiện tại phân tử lai. Ngày nay, sau khi phát hiện ra kỹ thuật PCR fan ta có thể phát hiện nay trực tiếp những VNTR với các đôi mồi đặc hiệu.
Một số trang đồ vật cơ bản cho phòng thí điểm phân tử
Để ứng dụng một số kỹ thuật sinh học tập phân tử ứng dụng trong y học tập như tách bóc chiết ADN - PCR.
1. Trang trang bị cơ bản
- thứ ly tâm thông thường trong phòng phân tích với ống ly trung khu (5 - 100ml) hoặc ly trọng tâm ống bé dại (0,5 - 2 pl). Sản phẩm ly trọng tâm lạnh.
- Tủ ấm, bình giải pháp thủy (tốt độc nhất vô nhị là bình gồm lắc).
- Tủ lạnh lẽo từ 4oC đến -20oC hoặc -80oC: tùy nút độ bảo quản mẫu, gồm thể bảo vệ ADN trong nitơ lỏng với thời hạn dài hàng chục năm.
- Tủ ấm 37oC, vật dụng đo pH, thiết bị lắc, sản phẩm công nghệ sấy khô, thiết bị hấp độ ẩm (tiệt trùng), tủ sấy với ánh nắng mặt trời cao, cân nặng (có thể cân được g, mg).
- Micropipet những loại: 0,5 - 100pl; đôi mươi - 100pl; 200 - 1000pl, các loại đầu týp mang đến micropipet.
- Ồng Eppendort, những loại ống đong, những loại chế độ thông thường ở trong nhà xét nghiệm sinh hóa như chai, cốc..., giấy thiếc, giấy chỉ thị màu.
2. Hóa chất
- Hóa chất cần sử dụng để bóc tách ADN - ARN
- hóa chất pha các dung dịch đệm
Tham khảo thực tập dt Y học bài bác “Một số nghệ thuật sinh học phân tử thông dụng vận dụng trong Y học”.
3. đông đảo máy thông dụng
- trang bị soi tử ngoại.
- Máy năng lượng điện di.
- máy PCR.
TỰ LƯỢNG GIÁ
1. Trình bày phương pháp tách bóc chiết ADN và cách thức điện di ADN.
2. Trình bày đặc điểm và chức năng của enzym số lượng giới hạn (enzym hạn chế).
3. Trình bày nguyên lý và các phương pháp xác định trình từ nucleotid vào phân tử ADN.
4. Nêu đặc điểm của ADN dò, cách thức tạo ADN dò.
5. Trình bày kỹ thuật Southern Blotting.
6. Trình diễn kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction): phản bội ứng chuỗi polymerase.
7. Nêu hiện tượng kỳ lạ đa hình về chiều dài của những đoạn ADN vì chưng enzym giới hạn làm cho (RFLP).