Công nghệ DNA tái tổ hợp
I. Mở màn Vào năm 1973, một tổ các nhà kỹ thuật đã tạo thành ra khung người sinh vật đầu tiên với các phân tử DNA tái tổ hợp. Theo đó, Cohen...
Bạn đang xem: Sinh học phân tử của tế bào
Sinh học tập Phân Tử là gì?
Sinh học tập phân tử tương quan đến các đại lý phân tử của chuyển động sinh học giữa những phân tử sinh học tập trong các khối hệ thống khác nhau của tế bào, bao hàm các tương tác giữa DNA, RNA, và các protein và quá trình sinh tổng hòa hợp của chúng, cũng tương tự việc điều chỉnh những tương tác này. Viết về Thiên nhiên vào khoảng thời gian 1961, William Astbury mô tả sinh học tập phân tử như sau:"... Ko phải là 1 trong những kỹ thuật như một cách tiếp cận, một phương pháp tiếp cận từ cách nhìn của mẫu gọi là công nghệ cơ bạn dạng với ý tưởng số 1 về tìm kiếm kiếm dưới các bộc lộ quy mô béo của sinh học cổ điển cho kế hoạch phân tử tương ứng. Với những dạng của những phân tử sinh học với <...> chủ yếu là tía chiều và kết cấu - điều ấy không tức là nó chỉ là việc sàng lọc về hình dáng học và đề xuất cùng lúc khám phá về nguồn gốc và chức năng."Mối quan hệ nam nữ với những khoa học viên học khác
Các nhà nghiên cứu về sinh học phân tử sử dụng các kỹ thuật rõ ràng có nguồn gốc sinh học tập phân tử tuy thế ngày càng phối hợp chúng với các kỹ thuật và phát minh từ dt học cùng hóa sinh. Không tồn tại một đường phân định giữa những nguyên tắc này. Hình dưới là sơ đồ biểu đạt một quan lại điểm hoàn toàn có thể có của các mối tình dục giữa các lĩnh vực:Quan hệ giản lược giữa sinh hóa học, dt học với sinh học tập phân tử |
Các chuyên môn trong sinh hoc phân tử:
Nhân phiên bản phân tử( molecular cloning):Một trong số những kỹ thuật cơ bản nhất của sinh học tập phân tử để nghiên cứu và phân tích hàm lượng protein là nhân phiên bản phân tử. Trong kỹ thuật này, DNA mã hoá cho protein vồ cập được nhân bản bằng cách áp dụng phản ứng nhân ren (PCR), với / hoặc các enzyme hạn chế vào một plasmid (vector biểu hiện). Một vector bao gồm 3 quánh trưng: gốc sao chép, vị trí đa nhân chiếc (multiple cloning site - MCS) và một marker chọn lọc thường là kháng thuốc chống sinh. Vị trí đầu tiên thuộc vị trí đa nhân mẫu là những vùng promoter với vùng ban đầu phiên mã điều chỉnh sự bộc lộ của gen nhân bản. Plasmid này rất có thể được chuyển vào vào tế bào vi khuẩn hoặc đụng vật. Vấn đề đưa DNA vào những tế bào vi khuẩn rất có thể được thực hiện bằng phương pháp chuyển đổi trải qua việc dung nạp DNA trần, phối hợp qua tế bào-tế bào hoặc bằng phương pháp truyền qua vector virus. Việc đưa DNA vào những tế bào eukaryote, như tế bào đụng vật, bằng các phương tiện vật dụng lý hoặc chất hóa học được hotline là chuyền nhiễm. Có một vài kỹ thuật chuyền nhiễm không giống nhau, ví dụ can xi phosphate, xung điện, chuyển gen trực tiếp vào protoplast cùng chuyền lây truyền liposome. Plasmid hoàn toàn có thể được tích hòa hợp vào cỗ gen, hiệu quả là sẽ có một sự thay đổi ổn định, hoặc có thể vẫn hòa bình với cỗ gen, hotline là transfection nhất thời.
DNA mã hoá cho 1 protein quan tiền tâm hiện đang ở vào tế bào, với protein hiện thời có thể được biểu hiện. Một loạt những hệ thống, như những promoter cảm ứng và những yếu tố tin hiệu hiệu tế bào nạm thể( specific cell-signaling factor), sẵn bao gồm để giúp bộc lộ protein mục tiêu ở nấc cao. Số lượng lớn protein sau đó hoàn toàn có thể được chiết xuất từ tế bào vi trùng hoặc tế bào eukaryote. Protein này có thể được chất vấn hoạt tính enzym vào nhiều trường hợp khác nhau, protein hoàn toàn có thể được kết tinh để hoàn toàn có thể nghiên cứu kết cấu bậc bố của nó, hoặc trong lĩnh vực dược phẩm, hoàn toàn có thể nghiên cứu buổi giao lưu của các phương thuốc mới chống lại protein
PCR( Polymerase Chain Reaction)PCR là 1 trong những kỹ thuật cực kì linh hoạt để xào luộc DNA. Bắt lại, PCR có thể chấp nhận được một chuỗi DNA cụ thể được xào luộc hoặc sửa đổi theo đầy đủ cách xác minh trước. Bội nghịch ứng cực kì mạnh mẽ với trong đk hoàn hảo có thể khuếch đại một phân tử ADN vươn lên là 1,07 tỷ phân tử trong vòng chưa đầy hai giờ. Chuyên môn PCR có thể đưa các enzyme giới hạn tới những đầu của những phân tử DNA, hoặc để chuyển đổi các bazơ quan trọng của DNA, tiếp đến là một phương pháp gọi là sự việc biến dị điểm( site-directed mutagenesis). PCR cũng hoàn toàn có thể được sử dụng để xác định liệu một đoạn DNA rõ ràng có trong một thư viện cDNA. PCR có tương đối nhiều biến thể, như PCR phiên mã ngược (RT-PCR) để khuếch đại RNA, và, vừa mới đây nhất, PCR định lượng có thể chấp nhận được đo đạc định lượng các phân tử DNA hoặc RNA.Điện di Gel( Gel electrophoresis)2% Agarose Gel vào Borate Buffer đúc vào một khay Gel (mặt trước, góc cạnh)Gel năng lượng điện di là một trong những công cụ thiết yếu của sinh học tập phân tử. Hình thức cơ bản là DNA, RNA, cùng protein có thể được bóc tách ra dựa vào trường năng lượng điện và kích thước của chúng. Trong quá trình điện di agarose gel, DNA với RNA rất có thể được tách bóc ra trên cơ sở kích thước bằng cách chạy DNA thông qua 1 gel agarose tích điện. Protein có thể được phân bóc tách dựa bên trên kích thước bằng phương pháp sử dụng gel SDS-PAGE, hoặc dựa trên kích thước và năng lượng điện của chúng bằng phương pháp sử dụng technology điện di gel 2D.
Macromolecule blotting và probea. Southern blottingSouthern blot được đặt tên theo nhà kỹ thuật Edward M. Southern do đã sáng tạo ra chuyên môn này. Southern blot là quy trình chuyển những phân tử DNA từ bỏ gel agarose lên một màng cùng nhờ kia giúp các nhà nghiên cứu định vị trình từ DNA phía bên trong một hỗn hợp phức tạp. Ví dụ: Southern Blot có thể được áp dụng để xác xác định trí một gen cụ thể trong tổng thể hệ gen.Lượng DNA cần thiết cho kỹ thuật này phụ thuộc vào vào form size và vận động đặc hiệu của chủng loại dò (probe). Các mẫu dò ngắn thường đặc hiệu hơn. Dưới những điều kiện tối ưu, có thể xác định được 0.1 pg DNA vào toàn vượt trình.b. Nothern blottingPhương pháp lai Northern blot là cách thức áp dụng mang lại RNA, lai DNA-RNA hoặc RNA-RNA. Phương pháp này được áp dụng để xác định kích thước và lượng chất của một mRNA đặc trưng trong một các thành phần hỗn hợp RNA. Kỹ thuật lai này được trở nên tân tiến vào năm 1977 vày James Alwine, David Kemp, và George Stark tại Đại học tập Stanfordc. Trong khi còn tất cả Western blotting với Eastern blottingd. DNA microarrayDNA microarray (DNA chip hoặc cpu sinh học) là một tập hợp các điểm DNA siêu nhỏ được đính trên một giá bán thể rắn. Những nhà khoa học thực hiện DNA microarray nhằm đo một giải pháp đồng thời nấc độ bộc lộ của lượng khủng gen hoặc những vùng đa gen của hệ gen. Từng điểm DNA đựng hàng picomoles (10-12 moles) của một trình từ gen sệt hiệu, được nghe biết như những mẫu dò (probes hoặc reporters xuất xắc oligos). Chúng rất có thể là một quãng ngắn của một gene hoặc một nhân tố ADN khác, được sử dụng để lai với 1 ADNc hoặc ARNc (hay ARN anti-sense) (được call là đích) dưới đk nghiêm ngặt. Sự lai chủng loại dò – đích thường xuyên được vạc hiện cùng định lượng bởi những chất ghi lại huỳnh quang (fluorophore-labeled), bội bạc (silver-labeled) hoặc sự phát quang bằng phản ứng hóa học (chemiluminescence-labeled) để xác minh mức độ lặp lại của những trình tự acid nucleic trong đích.
e.Allele-specific oligonucleotide (ASO)Oligonucleotide quánh hiệu allele (ASO) là 1 kỹ thuật được cho phép phát hiện những đột biến đổi cơ bản duy nhất mà lại không đề xuất kỹ thuật PCR hoặc gel electrophoresis. Ngắn (độ lâu năm từ trăng tròn đến 25 nucleotide), những đầu dò được dán nhãn sẽ tiếp xúc với DNA mục tiêu không trở nên phân mảnh, quá trình lai tạo xảy ra với độ sệt hiệu cao vày độ dài ngắn của những đầu dò và thậm chí là một sự thay đổi cơ bạn dạng duy nhất sẽ cản ngăn sự lai tạp. DNA mục tiêu tiếp nối được rửa sạch mát và các đầu do tất cả dán nhãn ko lai được loại bỏ. DNA mục tiêu tiếp nối được phân tích cho sự hiện hữu của đầu dò trải qua phóng xạ hoặc huỳnh quang. Trong thí điểm này, như trong hầu hết các nghệ thuật sinh học tập phân tử, phải bao gồm một kiểm soát và điều hành để bảo vệ thử nghiệm thành công.
SDS page |